长链二元酸发酵生产

2017-09-07 | 发布者:汇科信息


长链二元酸(Long chain dicarboxylic acids)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸(简称DCn),包括饱和及不饱和二羧酸,是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品,是化 学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料。

      长链二元酸在自然界中不单独存在,而且大多数饱和长链二元酸在化学工业中难以合成生产。美国、德国、俄国和日本等国家都曾对长链二元酸的化学合成和利用进行过长期的开发和研究。但到目前为止,能用化学方法合成的最长饱和碳链二元酸是十三碳二元酸,只有十二碳二元酸(DC12)可用化学法工业生 产,但反应过程中需要高温高压催化剂,生产上需要防火防毒防爆装置,而且工艺复杂,产品纯度不高、收率低、成本高、污染严重;而不饱和长链二元酸则在化学工业中无法合成。另外,采用碱热解蓖麻醇酸法可以用蓖麻油为原料来制取癸二酸,十三碳二元酸可以从菜籽油中提取甘油芥酸酯然后用臭氧氧化制取,十五碳二元酸可以从蒜头果油的脑神经酸裂解制取,但产品纯度较低,而且原料来源有限。
      发酵法生产长链二元酸(利用微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用,在常温常压下分别氧化长链正烷烃两端的两个甲基,一步加上四个氧原 子,生成相应链长的各种长链二元酸)以丰富的石油资源为原料,克服了单纯的化学合成方法以及植物油裂解制取方法的各种不足,为长链二元酸的大量生产开辟了新的途径。

1 微生物源的研究
1.1 产长链二元酸微生物种类的研究
      能利用石油烃类的细菌、霉菌和放线菌的种类很多。Kester和Foster首先观察到棒状杆菌能将正烷烃分子的两末端氧化成饱和二元脂肪 酸。以后在假单胞杆菌、葡萄孢菌等许多微生物中也观察到ω-氧化反应的存在,但是一般生成二元酸的量很低,而且大都只积聚短碳链二元酸。已报道的利用脂肪 族正烷烃生长的酵母菌的属有:假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属、丝孢酵母属、酵母属、酒香酵母属、 掷孢酵母属、白地霉、拟内孢霉属、娄德酵母属等等。其中,假丝酵母属(can-dida)的酵母菌是正烷烃发酵生产二元酸的高产微生物。
1.2 产长链二元酸假丝酵母菌的选育
      1972年Uchio和Shiio成功地应用阴沟假丝酵母菌(Candida cloucae)310变种MR-12,在含有15%十六碳烷、1.4%醋酸及其他原料的培养基中发酵及休止菌体转化,十四碳二元酸的发酵产量最高达 61.5g/L,转化产量为44g/L,烷烃的利用率在60%左右。1979年中国科学院上海植物生理研究所沈永强等报道用秋水仙碱和樟脑对热带假丝酵母 (Candida tropicalis)进行多倍体诱变育种,获得长链二元酸发酵的高产菌株,十三碳二元酸发酵产量达62.7g/L,转化产量达86.6g/L。1979 年中国科学院微生物研究所报道用通过亚硝基胍、紫外线和亚硝酸钠诱变处理得到的热带假丝酵母U3221突变株发酵,获得较高产量的长链二元酸。日本植村等用一株热带假丝酵母突变株M2030工业化生产十三碳二元酸,产量达130g/L,纯度为94%。Picataggio等采用基因工程技术构建了一株β- 氧化阻断型菌株H5343,在小发酵罐中发酵正十二烷烃生产十二碳二元酸,产酸水平从95g/L提高到140g/L。
      陈远童等认为:想高产C15以上的长链二元酸,必须培育出既具有高活力ω-氧化酶又具有低活力β-氧化酶的优良生产菌株。焦鹏等为提高热带假 丝酵母转化烷烃生产长链二元酸的能力,建立了通过制霉菌素和氯丙嗪两步浓缩和双重影印技术筛选获得α、ω-氧化增强、β-氧化减弱的热带假丝酵母诱变菌株的筛选体系。
      到目前为止,世界上用于发酵生产长链二元酸研究和工业生产的假丝酵母都是从自然界中筛选得到的热带假丝酵母野生菌株(野生菌株产二元酸水平都很低,而且都是10个碳以下的短链混合二元酸)经过多次诱变筛选等手段选育而得,可以氧化癸烷到十八烷的正烷烃生成相应链长的长链二元酸(癸二酸到十八碳 二元酸)。

2 发酵机理的研究

      微生物对正烷烃的氧化类型可分为三种:

    l)正烷烃分子末端的甲基氧化生成醇、醛、酸的单端氧化;

    2)正烷烃分子第二碳的亚甲基氧化形成甲基酮的次末端氧化;

    3)正烷烃分子两端的甲基氧化形成二羧酸的双端氧化。

      热带假丝酵母生产长链二元酸的发酵过程分为菌体生长期和产酸期两大阶段,在菌体生长期,菌体主要利用蔗糖来增殖以获得尽可能多的菌体,其中的烷烃仅起诱导作用,用于产生进入代谢途径的各种酶;产酸期发酵液中糖含量很低,菌体的增殖量较少,菌体主要代谢烷烃形成发酵产物长链二元酸。在菌体转化烷 烃生成长链二元酸的代谢过程中,烷烃被吸收进入细胞后,首先在微粒体中被细胞色素P450酶系(细胞色素P450酶和细胞色素还原酶)α-氧化生成α-一 元醇,α-一元醇再进一步由醇氧化酶和醛脱氢酶催化氧化成α-一元酸。接着,α-一元酸再在相同酶系的催化下经过ω-氧化生成目的产物二元酸。此外,在 α、ω-氧化过程中生成的一元酸和二元酸都可以被肉毒碱酯酰转移酶转移进入微体中经过β-氧化而代谢消耗掉。所以在假丝酵母细胞中α、ω-氧化是一个需要 增强的代谢途径,而β-氧化则是需要削弱的代谢途径。余志华等认为热带假丝酵母的长链二酰辅酶A合成酶的酶活与它同化正烷烃和氧化积累二元酸有一定的关系。陈远童等以正十六烷为实验材料,发现适量丙烯酸的加入可以抑制二羧酸的β-氧化,从而降低酵母菌对十六碳二元酸的分解,增加十六碳二元酸的积累量,但 其浓度较大时就明显抑制菌体生长。
      焦鹏等实验表明:由于代谢过程中细胞色素P450酶是关键酶,在一定范围内,细胞色素P450酶活与细胞产酸能力呈正相关。在热带假丝酵母中细胞色素P450酶可以由烷烃诱导产生,其诱导产量和烷烃的转化量存在线性关系。
      张志禹等报道:二元酸分泌过程是烷烃代谢过程中的重要步骤,pH在7.4~8.2范围内,足够高的pH对分泌和产酸是必需的。二元酸钠盐明显不利于分泌过程。二元酸的分泌相对于胞内ω-氧化过程是快速过程。
      长链二元酸发酵是典型的气-液(水相)-油(烷烃)-固(菌体)四相体系,其中油水双液相间的乳化现象增加了相间混合的复杂。同时,由于从长链烷烃生物氧化成含氧的长链二元酸和发酵过程中大量菌体的维持代谢,决定了二元酸发酵过程较其他发酵需要更高的体积传氧量。另外,发酵过程中放出的热量比较高。

3 发酵技术的研究
      发酵过程中,菌体浓度测定采用干重法或比浊法,二元酸分析采用NaOH溶液滴定法或气相色谱法。沈永强等应用休止菌体转化法将正烷烃转化为长链二元酸,反应产物纯度很高,提取也很方便,而且整个转化过程不需无菌操作,工艺较简单。这种情况下,菌体固定化连续转化使用技术的研究比较诱人。工业化生产长链二元酸的发酵过程中,种子液的制备有多种方法:1)从发酵罐中取出部分发酵液作为另一罐发酵所需的种子液,依此类推;2)从发酵罐取出的部分发酵液加入到以糖为底物的培养基里进行培养,然后从中得到的培养物再加到下一罐内;3)从发酵罐取出的部分发酵液加入正构烷烃,混合均匀静置后,收集上浮层作为下一罐的种子液。日本味の素公司赤坯四郎归纳了长链二元酸产生菌培养基组成的一些原则:使用C12~C18碳源,也可用其他可以被同化的碳源生产菌体,生长达最大值前后添加足够的正构烷烃;或将在各种碳源上生长的菌体洗净后,在缓冲液中依靠酶反应产生长链二元酸。矿业公司为提高长链二元酸产率,采用了正构烷烃和糖(如葡萄糖、蔗糖或糖蜜)构成的双底物碳源,并一起加入到培养介质中,这样可提高二元酸产生菌的繁殖速率,以便在较短时间使正构烷烃转化成二元 酸。发酵培养基中添加适量的表面活性剂和乳化剂可以强化发酵过程中的烷烃与水的混合,以利于产酸。发酵培养基与种子培养基基本相同,在正构烷烃占较大比例的液体培养基中加入种子培养基后,搅拌通气培养,生成并积累长链二元酸。
      日本矿业公司认为培养初期的pH为3~5时利于酵母菌的生长,而产酸期的pH应为6.5~7.5,产酸期维持在中性偏碱的环境,有利于ω-氧化而抑制β-氧化。任刚等认为:OH-可以中和二元酸中的H+使胞内外H+浓度梯度加大,从而使二元酸加速通过细胞膜而运送到胞外,减少二元酸在胞内的累积性抑制,在偏碱性环境中二元酸产量明显上升。当吐温60和青霉素添加量合适时,可使菌体受到破坏最少而细胞膜的通透性达到最高值,使得底物正烷烃和产物长链二元酸能更快地通过细胞膜而加快产酸的进程。尿素作为培养液中的氮源,不仅影响着细胞色素P450酶及羟基化酶的活力和其它相关酶的活力,还影响细胞的超微结构。尿素在低浓度时可以促进二元酸的产量,但在高浓度(>0.2%)时,由于尿素促进了菌体的三羧酸循环和乙醛酸循环从而增强了菌体的β- 氧化能力,使二元酸的积累降低。丙氨酸对菌体内三羧酸循环、过氧化氢酶和谷氨酸脱氢酶活力也存在明显的影响,在0.5%左右时能较好地促进二元酸的产生。
      在发酵初期加入烷烃时,高浓度的烷烃对于菌体的生长有一定的抑制作用,所以在发酵初期不加入烷烃或加入少量的烷烃(小于2%v/v),让菌体得到快速的生长,待菌浓达到一定水平之后再补加足量的烷烃诱导细胞色素P450酶系的表达,从而增加产酸量。进入产酸期24h和72h后补加蔗糖,对产酸有一定的促进作用;而产酸期48h后补加蔗糖,则对产酸有明显的促进作用,最多可提高17.3%。糖类如葡萄糖、乳糖、木糖和麦芽糖等均能对β-氧化具有抑制作用从而提高二元酸的纯度,且作用比蔗糖好。添加醋酸盐也可以促进菌体浓度的增加和二元酸的合成。
      长链二元酸发酵要求生物反应器具有良好的流动混合性能,强化的供氧能力以及较大的热量移出性能。日本矿业公司为了解决20m3十三碳二元酸发 酵罐中的油水混合、氧传递及热量移出问题,采用了大功率搅拌器和从发酵罐中移出部分发酵液冷却循环的方法来达到要求。上海溶剂厂在10t搅拌罐上采用了空气自吸的方式来达到传氧的目的。抚顺石油化工研究院在十三碳二元酸发酵中设计了120L适合二元酸流加发酵的气升式环流反应器。

4 长链二元酸的提取和纯化
      从发酵产物中工业化分离长链二元酸不可能采用实验室中乙醚等溶剂萃取这种高成本的提取方法。由于发酵液中存在乳化剂,直接用离心和过滤的方法 很难除尽菌体,结晶后产品中的菌体和蛋白质含量较高,从而导致塑料变脆和香料品质下降。可用壳聚糖絮凝法除去发酵液中的大部分菌体和蛋白质。
      日本三井石化工业公司从分离菌体的滤液中用无机酸析出长链二元酸,然后用芳烃抽提析出二元酸。用多元醇或含两个以上醛基的有机物与此抽提液混合,使抽提液中的杂质选择性地转移到非芳烃溶剂中,最后从抽提液中结晶析出二元酸。类似地,也可以用由芳烃、C4以上的醇和酮以及C6以上的醛类组成的混合溶剂高温抽提,然后冷却结晶出二元酸。
      三井石化工业公司的另一种二元酸分离技术是:把pH4的酸析液加热回流一定时间,然后冷却结晶出二元酸。类似地,在碱性条件下于回流温度加热处理无菌发酵液,然后酸析结晶出二元酸。用活性炭在较高温度下对除菌后的发酵液进行脱色处理能得到无色二元酸。
       可以将二元酸发酵液碱化到pH>10,并且加入少量漂白粉或次氯酸盐防止后发酵。进一步加入硅藻土混合均匀,压滤后的滤液加无机酸使二元酸析出,加热晶液到较高温度使晶体生长数小时,再压滤回收二元酸,并除去加入的漂白粉以免影响产品纯度。二元酸的发酵液也可以在碱性条件下静置10h以上后离心除去 菌体。在离心清液中加入硅藻土,再用压滤机处理得到更清的滤液。对清滤液酸析沉淀得到的二元酸再通过碱化溶解,并加入白土混合后压滤,其滤液再次酸析,并在回流温度进行热处理,最后回收二元酸结晶。
       为了除去产品中的蛋白质和热带假丝酵母菌体,也可采用螺旋卷式超滤器与沙滤装置相结合用于精制二元酸发酵产品,这种后处理法得到的产品纯度很高。

5 工业应用前景
      在长链二元酸应用开发研究中,中国和日本处于国际领先地位。日本的研究单位主要有:味の素公司中央研究所、日本能源公司、矿业公司、三井石化工业公司等。在中国,20世纪70~80年代的研究单位主要有:中国科学院上海植物生理研究所、中国科学院微生物研究所和中国科学院沈阳林业土壤研究所等;20世纪90年代以后的研究单位主要有:中国科学院微生物研究所、清华大学和抚顺石油化工研究院等。
      日本首先实现工业化,矿业公司1982年开始以100t/年的规模生产十三碳二元酸,并于1985年产量达200t/年;当时中国的年产量只 有几十吨,都用于合成香料麝香-T。在中国,至2001年,较大规模工业化生产长链二元酸的公司(已建或正在建设中)有10个左右。早期成功实现较大规模化生产的公司为1997年底建成的年产300t二元酸、200t尼龙工程塑料和500t新型尼龙热熔胶的山东省淄博广通化工有限公司,该公司以十二碳二元酸为原料合成的尼龙1212的主要性能都优于目前进口的尼龙11和尼龙12,生产的新型尼龙热熔胶与德国生产的H104热熔胶性能相当;规模最大的为正在建设中的河北省石家庄联兴包装用品有限公司,可年产1000t二元酸、500t尼龙1212和500t热熔胶。
      发酵法生产长链二元酸的主要原料为石油中的液蜡,中国抚顺、锦西、大庆、燕山、林源、南京、荆门等地炼油厂都有生产,液蜡资源丰富、成本较 低;另一方面,长链二元酸衍生产品不仅市场广阔,而且附加值高。总而言之,发酵法生产长链二元酸条件温和、步骤少、收率高、成本低,相对于化工合成法和裂解提取法而言,有着无可比拟的优势。
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